目的 利用网络药理学和分子对接技术探讨大承气汤对肠癌术后肠上皮修复的分子靶点和作用机制。方法 通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库检索获得大承气汤中“大黄”、“芒硝”、“枳实”、“厚朴”等药物的活性成分和作用靶点。在Gene-Cards数据库和OMIM数据库以“Repair of intestinal epithelium in colon cancer”为关键词检索获得疾病相关靶点。利用微生信平台找出大承气汤靶点和疾病靶的交集靶点。通过Cytoscape3.10.3构建药物-关键化学成分-疾病靶点网络图，利用String数据库和Cytoscape3.10.3以及Cytoscape3.7.1绘制靶点蛋白互作网络图并进行拓扑分析，找出关键靶点蛋白并进行可视化处理。利用DAVID数据库对大承气汤治疗肠癌术后肠上皮修复的靶点进行GO和KEGG富集分析。采用AutoDock1.5.7和PyMol进行核心成分和靶点对接以及可视化处理。结果 筛选得到药物-疾病靶点244个。网络拓扑分析得到关键核心靶点AKT1、IL6、EGFR、HSP90AA1；通过GO富集分析得到条目621个，主要为炎症调节和趋化性调节；KEGG富集分析获得161条信号通路，主要通路为癌症的发病途径、PI3K-Akt 信号通路、癌症中的蛋白聚糖，与肠道肿瘤的发生发展及肠上皮修复存在着密切关系。结论：运用网络药理学探讨了大承气汤结肠癌术后肠上皮修复作用的靶点和通路，为深入研究大承气汤对结肠癌术后肠上皮修复的作用机制提供依据且对大承气汤的临床应用和药理研究提供理论基础。

关键词：网络药理；大承气汤；肠癌术后；肠上皮修复

Exploring the mechanism of action of Da Cheng Qi Tang on intestinal epithelial repair after colon cancer surgery based on network pharmacology and molecular docking

Abstracts: Purpose :To explore the molecular targets and mechanisms of action of Da Cheng Qi Tang on intestinal epithelial repair after surgery for intestinal cancer using network pharmacology and molecular docking techniques. Methods: The database of TCMSP was searched to obtain the active ingredients and action targets of “Rhubarb”, “Mirabilite”, “Citrus aurantium” and “Hou Pu” in Dachengqi Tang, The active ingredients and targets of “Da Huang”, “Mirabilite”, “Citrus aurantium” and “Hou Pu” in Da Cheng Qi Tang were searched in TCMSP database. The Gene Cards and OMIM databases were searched with the keyword “Repair of intestinal epithelium in colon cancer” to obtain the disease-related targets. The intersection of  Dachengqi Tang targets and disease targets was identified by using the Wei-sheng Letter Platform. Cyto-scape 3.10.3 was used to construct a drug-key chemical component-disease target network diagram, and String database, Cyto-scape 3.10.3 and Cyto-scape 3.7.1 were used to draw target protein interaction network diagrams and perform topology analysis to identify and visualize the key target proteins. GO and KEGG enrichment analyses were performed on the targets of intestinal epithelial repair after surgery for intestinal cancer treated with Da Cheng Qi Tang using DAVID database. Auto-Dock 1.5.7 and PyMol were used for core component and target docking and visualization. Results Screening yielded 244 drug-disease targets. Network topology analysis yielded key core targets AKT1, IL6, EGFR, HSP90AA1; GO enrichment analysis yielded 621 entries, mainly for inflammatory regulation and chemotaxis regulation; KEGG enrichment analysis yielded 161 signaling pathways, the main pathways were cancer pathway, PI3K-Akt signaling pathway, and proteoglycan in cancer, which have a significant relationship with intestinal tumor development and intestinal epithelial repair. development and intestinal epithelial repair. Conclusion The targets and pathways of the postoperative intestinal epithelial repair effect of Dachengqi Tang in colon cancer were investigated by network pharmacology, which provided the basis for the in-depth study of the mechanism of Dachengqi Tang's effect on the postoperative intestinal epithelial repair of colon cancer, and also provided the theoretical basis for the clinical application of Dachengqi Tang and the study of the pharmacology of Dachengqi Tang.

Keywords：Network pharmacology; Da Cheng Qi Tang; postoperative intestinal cancer; intestinal epithelial repair

1. 引言

结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是全球第三大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因[1]，临床上结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）外科常规治疗方法为内镜下切除、局部切除或肠段切除术[2]，通常存在不同程度的肠道屏障减弱的并发症[3]，此并发症常导致患者胃肠功能紊乱进而导致患者腹泻、腹胀，使得患者术后生存率变差。肠道屏障功能的主要特征是肠道通透性，而肠道通透性与肠道共生菌群和肠上皮密切相关[4][5]。肠上皮在营养、信号传导和作为环境屏障方面起着重要作用[6]，同时肠粘膜表面还为数十亿肠道细菌提供了栖息地，肠道上皮通透性是通过以肠上皮为结合微生物组和免疫系统之间的三向相互作用来调节[7]。炎性环境和肿瘤环境会增加肠道的通透性，许多肠道病原体通过改变肠道上皮紧密连接的结构和功能来主动破坏肠上皮屏障进一步对肠上皮的修复产生障碍[8]，因此改善肿瘤环境以及肠道的炎性环境，能在一定程度上促进肠上皮的修复，从而调节肠道功能。

现代药理研究发现大黄具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[9]，芒硝[10]芒硝的主要化学成分为十水合硫酸钠，在临床中均具有润软坚、泄热消肿的功效。，枳实具有调节胃肠功能、抗炎、抗氧化等作用[11]，厚朴[12]同样具有抗炎、抗氧化等作用，诸药合用可增强肠道屏障，调节肠道功能。本文拟通过网络药理学探讨大承气汤对肠道组织修复从而调节肠道功能的作用机制，以期为中医药治疗肠癌术后肠上皮修复提供理论依据。

2. 方法

2.1 大承气汤潜在活性成分和靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台[13]（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库以“大黄”、“枳实”、“厚朴”三个药物分别检索对应药物的活性成分，设定口服生物利用度OB (Oral bioavailability)≥30%，类药性DL (Drug-likeness)≥0.18，对相应药物活性成分进行筛选，芒硝在TCMSPs数据库中无法查询，在herb数据库（http://herb.ac.cn/Search/）中进行查找成分及靶点。将获得的活性成分在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取成分对应的smiles，并在Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/index.php）平台[14]对成分进行分析筛选并获得有效活性成分。将获得的有效活性成分在Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）平台进行靶点预测，将可能性低于0.1的摒弃并获得成分对应靶点。

2.2 疾病相关靶点的获取

在Gene Cards数据库[15]（http：//www.genecards.org）和OMIM数据库（http：//www.omim.org）中以“Repair of intestinal epithelium in colon cancer”为检索词检索疾病相关靶点蛋白。将两个数据库获得的靶点合并，并删除重复值作为疾病的相关靶点蛋白。

2.3 蛋白互作网络构建以及核心靶点的筛选

STRING数据库（https://cn.string-db.org/）是一个基于公共数据库和文献信息的蛋白质相互作用网络数据库，在STRING数据库中多种蛋白（Multiple proteins）选项将治疗潜在靶点导入[16]，得到PPI网络图和主要靶点信息。

2.4 GO和KEGG分析

使用DAVID（https://davidbioinformatics.nih.gov/summary.jsp）平台[17]输入药物与疾病共同靶点，获得GO以及KEGG分析数据，并利用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）对结果进行可视化。

2.5 分子对接

将获得的核心成分从PubChem数据库中获得成分的3D结构[18]，将获得的核心靶点通过uniprot数据库设置物种为人搜索核心靶点获得对应的ID，利用对应ID在PDB数据库进行检索获得对应的pdb格式的文件，在pymol中进行去水和去除原始配体的操作后保存文件，导入AutodockTools-1.5.7软件对进行验证。

3. 结果

3.1 大承气汤潜在活性成分和靶点

通过TCMSP数据平台对大承气汤中药物进行筛选，获得大黄3个主要活性成分，对应靶点126个；枳实17个主要活性成分，对应靶点1307个；厚朴主要活性成分7个，对应靶点409个，其中芒硝成分在Swiss ADME平台无法验证，直接取用herb中提供的7个靶点，对四药靶点进行去除重复项结果显示药物共同靶点为571个作用靶点。

3.2 疾病靶点

通过Gene Card数据库以“Repair of intestinal epithelium in colon cancer”为关键词进行搜索，得到8025个靶点，根据“Relevance score”进行连续中值定位法靶点进行筛选，最后得到2006个疾病靶点。同样以“Repair of intestinal epithelium in colon cancer”为关键词在OMIM数据库中进行筛选后得到499个疾病靶点。合并两数据库靶点去除重复项后得到共2459个疾病靶点蛋白。将疾病靶点和药物靶点导入微生信平台取交集并做出Venn图并得到交集靶点244个。如图表 1、图表 2。

图表 1疾病与药物靶点韦恩图

图表 2药物-成分-靶点，红色代表方剂名称，橙色代表药物组成，绿色代表药物成分，蓝色代表关键作用靶点。

3.3 蛋白互作分析

将获得的244个交集靶点导入STRING平台绘制药物和疾病交集靶点的PPI网络图。如图表 3。在排除游离的无效靶点后得到244个节点，5257条边。将结果保存为tsv格式导入Cytoscape3.10.3软件，再通过CentiScape2.2插件进行分析，筛选得到等45个核心靶点，根据Degree对靶点进行可视化处理，如图表 4，其中度值排名靠前靶点AKT1、IL6、EGFR、HSP90AA1等，这些靶点即是大承气汤对肠癌术后肠上皮修复的核心靶点。

图表 3 蛋白互作网络图

图表 4核心靶点

3.4 GO和KEGG分析

将45个核心靶点通过DAVID平台进行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析中BP（Biological process）425条、CC（Cellular component）60条、MF（Molecular function）136条，通过Count值分别取三项前10条进行分析，发现生物过程（Biological process，BP）条目主要集中在RNA 聚合酶 II 对转录的正负调控、对异生物刺激的反应等，显著富集在对异生物刺激的反应。CC主要集中在细胞质、细胞核、核浆、含蛋白质的复合体等，显著富集在细胞质及含蛋白质的复合体。MF主要集中在蛋白质结合、ATP 结合、酶结合等方面，显著富集在蛋白质结合和酶结合。

KEGG分析核心靶点主要涉及161条通路，根据富集基因数进行筛选前20条通路主要集中富集在癌症的发病途径、PI3K-Akt 信号通路、癌症中的蛋白聚糖、化学致癌--受体激活、内分泌抵抗等信号通路，其中显著富集在癌症的发病途径以及内分泌抵抗等信号通路。

图表 5 GO

图表 6 KEGG

3.5 分子对接

对接结果显示，如下表所示。通过分子对接实验，搜集分子对接对接的结合能数值结果就（见下表）。当结合能<-1kcaLmol，提示可自发进行结合，当结合能<-5kcaLmol时提示结合性能较好，据图显示大承气汤中核心成分和与核心靶点的结合能数值均<-1kcaLmol，提示可自发进行结合，对接结果见图6。其中luteolin与AKT1结合有5条氢键，Isosinensetin与IL6结合有2条氢键，Magnolol与EGFR结合有2条氢键，honokiol与HSP90AA1结合有2条氢键，形成的复合物具有较高的构象稳定性。

图表 7 AKT1-luteolin

图表 8 IL6-Isosinensetin

图表 9 EGFR-Magnolol

图表 10 HSP90AA1-honokiol

4. 讨论

肠上皮是环境的动态屏障，并整合了各种信号，包括来自代谢物、共生微生物群、免疫反应和衰老压力源的信号[6]。CRC 是一种复杂的肿瘤，涉及多种致癌信号通路，其分子机制尚不完全清楚，临床上常用相应手术进行治疗，对肠道组织有直接作用的影响，加上肿瘤本身对肠道正常组织的作用，肠道组织的修复受多种因素影响。术后修复过程中炎性反应、氧化应激作用也很大程度上影响肠上皮修复，从而出现肠道功能紊乱等并发症。

本文通过网络药理学及生物信息学方法筛选出大承气汤27个有效成分，240个关键靶点，经PPI网络构建得到AKT1、IL6、EGFR、HSP90AA1等靶点与疾病密切相关。通过关键靶点的成分筛选出尤帕汀（EUPATIN）、木兰醇（Magnolol）、木犀草素（luteolin）、和厚朴酚（honokiol）、和异橙黄酮（Isosinensetin）可能是大承气汤治疗术后肠上皮修复的关键活性成分，涉及到的信号通路有癌症的发病途径、PI3K-Akt 信号通路、癌症中的蛋白聚糖、化学致癌--受体激活、内分泌抵抗。

研究发现尤帕汀[19]是类黄酮中的一种，类黄酮是存在于植物新生部分中的天然化合物，具有抗氧化活性，抗癌等活性。孙烨涵[20]等通过常传统药物网络药理学研究发现尤帕汀可作为在IL-6/JAK-STAT3通路中治疗癌症腹水的主要有效成分。Rosine[21]等学者在分析化合物抑制巨噬细胞中NO产生潜力的研究中根据NO抑制百分比显示发现尤帕汀具有较高的抑制活性，相对于对照具有超过100%的抑制作用。木兰醇又叫厚朴酚[22]，具有抗炎、抗氧化、抗癌症以及胃肠道功能的保护作用。张鹤，唐军[23]等通过网络药理分子对接技术结合细胞实验发现木兰醇可能是其对CRC抗癌作用的药理学基础。李平萍[24]等通过动物实验发现厚朴酚可增加有益菌的数量，减少致病菌的数量，从而有效改善小鼠肠道菌群，减轻脂多糖诱导的炎症反应，厚朴酚高剂量组通过上调AKT、BCL-XL等基因，激活P3K-AKt信号通路发挥抗炎作用。木犀草素[25]也是一种类黄酮，可以成为预防和治疗不同类型癌症的重要补充药物。外国学者[26]发现木犀草素可以抑制促炎介质并调节各种信号通路，同时发现许多体外结果与使用木犀草素进行伤口愈合相矛盾，尤其是在早期阶段，但体内伤口愈合研究指出了有益的效果，对术后组织修复有积极作用。和厚朴酚[27]是一种抗氧化活性的天然化合物，Arun等学者通过小鼠造模研究发现和厚朴酚和六氟和厚朴酚通过增加SIRT3表达在促进肠道神经元存活和分化中起重要作用。厚朴酚[28]可以通过降低GPX4的活性来诱导CC细胞中的铁死亡，厚朴酚作为一种潜在的治疗药物，通过多种信号转导机制和多种途径显示出良好的抗癌作用。异橙黄酮是一种具有抗氧化作用的类黄酮，李瑶瑶[29]通过动物实验研究发现异橙黄酮经皮给药通过激活Nrf2通路提高D-gal诱导细胞衰老小鼠的抗衰老和抗氧化能力。秦义乌[30]等通过证明异橙黄酮可以通过激活 Keap1/Nrf2 信号传导来增加抗氧化酶的作用，从而降低细胞内 ROS 的整体水平。

本研究将大承气汤作用于肠上皮修复的靶点基因进行GO和KEGG分析，进一步探讨大承气汤有效成分治疗术后肠上皮修复的GO生物过程以及信号通路。GO 富集分析结果显示，大承气汤治疗肠上皮修复主要涉及信号转导、对异生物刺激的反应、积极调节细胞群增殖、凋亡过程、RNA聚合酶II对转录的正负调控等生物过程，而这些生物过程的主要靶基因包括 AKT1、IL6、EGFR、HSP90AA1等。KEGG富集通路分析结果可以发现，大承气汤治疗肠癌术后肠上皮修复的有小机制与（PI3K）/AKT、IL-6、EGFR以及HSP90AA1等信号通路有关。磷脂酰肌醇3激酶[31]（PI3K）/AKT（也称为蛋白激酶B、PKB）信号传导调节各种细胞过程，例如细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期、蛋白质合成、葡萄糖代谢和端粒活性。IL-6 [32]是慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、癌症和细胞因子风暴的主要参与者，免疫反应和伤口愈合过程中的急性炎症是一种控制良好的反应，而慢性炎症和细胞因子风暴是不受控制的炎症反应。EGFR[33]（Epidermal Growth Factor Receptor）是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。各种蛋白质通过影响再生能力和分化来控制表皮的稳态，例如 EGFR（表皮生长因子受体）。分子伴侣HSP90AA1[34]是各种生理和病理条件下各种细胞过程中的关键调节因子，对术后肠道修复以及术后肿瘤再生发挥重要作用。分子对接中显示多种核心成分与AKT1、EGFR等PPI核心蛋白拓扑参数靠前的的大分子受体结合构象较为稳定，具有良好的结合活性。

综上所述,本研究通过网络药理学的方法发现了大承气汤治疗肠癌术后肠上皮修复的活性成分、作用靶点、涉及的生物过程和信号通路。说明了大承气汤治疗术后肠上皮修复是多成分多靶点、多通路的生物过程,为进一步研究中药治疗肠癌术后调节肠道功能提供了新思路和切入点。由于本研究的数据主要从数据库检索和计算机计算获得,各种平台的预测软件尚存在一定的局限性,有待于通过体内外实验进一步验证成分和靶点间的作用和关系,深入揭示其治疗肠上皮修复的作用机制。